Корисник:Monka005/Southern blot

Агарозни гел под ултраљубичастим осветљењем након примене методе Southern blot .

Southern blot је метода која се користи у молекуларној биологији за откривање специфичне секвенце ДНК у узорцима ДНК. Southern blot комбинује пренос фрагмената ДНК који су раздвојени гел-електрофорезом на филтер мембрану и накнадно детектовање фрагмената хибридизацијом са обележеним пробама.

Метода је добила име по британском биологу Едвину Садерну (Edwin Southern) који ју је први пут објавио 1975. ^[1] Остале методе блотирања ( Вестерн блот (Western blot), ^[2] Northern blot, Eastern blot или Southwestern blot ) користе сличне принципе, али користећи РНК или протеин, именоване су по аналогији са Southern blot. ^[3]

Метод

Рестриктивне ендонуклезе користе се за сечење ланца ДНК велике молекулске масе на мање фрагменте.
Електрофореза ДНК фрагмената на агарозном гелу како би се фрагменти раздвојили по величини.
Ако су неки фрагменти ДНК већи од 15 кб, тада пре анализе гел може бити третиран киселином, као што је разблажена HCl . Ово доводи до делимичне хидролизе молекула ДНК узрокованом депуринацијом и на тај начин омогућава ефикаснији пренос више мањих фрагмената молекула ДНК са гела на мембрану.
Ако се користе методе алкалног преноса, ДНК гел се ставља у алкални раствор (који обично садржи натријум хидроксид ) да би се денатурисала дволанчана ДНК. Денатурација у алкалном окружењу може побољшати везивање негативно наелектрисаних остатака тимина ДНК за позитивно наелектрисане амино групе мембране, раздвајајући дволанчану ДНК на једноланчане ДНК молекуле потребне за каснију хибридизацију са пробом (види доле), такође уништава сваку заосталу РНК која може још увек су присутна у ДНК. Избор алкалних уместо неутралних метода преноса, међутим, често је емпиријски и може д^{[ <span title="This claim needs references to reliable sources. (February 2009)">цитат је потребан</span> ]}^{[ <span title="This claim needs references to reliable sources. (February 2009)">цитат је потребан</span> ]}овести до идентичних резултата. ^{[тражи се извор]}
На врх (или испод, у зависности од правца преношења) гела се поставља слој нитроцелулозне (или алтернативно најлонске ) мембране . Притисак се наноси равномерно на гел (било усисавањем, било постављањем снопа папирних пешкира и тежине на мембрану и гел), како би се осигурао добар и равномерни контакт гела и мембране. Ако се преноси усисавањем, користи се 20X SSC пуфер да се осигура заптивање и спречи сушење гела. Пренос пуфера капиларним деловањем из региона високог водног потенцијала у подручје ниског водног потенцијала (обично филтер папир) се затим користи за премештање ДНК из гела на мембрану; јонске везе вежу ДНК на мембрану због негативног наелектрисања ДНК и позитивног наелектрисања мембране.
Мембрана се затим пече у вакууму или обичној пећи на 80 °C током 2 сата (стандардни услови; нитроцелулозна или најлонска мембрана) или изложени ултраљубичастом зрачењу (најлонска мембрана) за трајно везивање пренесене ДНК на мембрану.
Мембрана је затим изложена проби за хибридизацију - јединствен фрагмент ДНК са специфичном секвенцом чија се присутност у циљној ДНК треба одредити. ДНК проба је обележена тако да се може детектовати, обично укључивањем радиоактивности или обележавањем молекула флуоресцентним или хромогеним бојама . У неким случајевима проба за хибридизацију може да се направи од РНК, а не из ДНК. Да би се осигурала специфичност везивања пробе за ДНК узорка, најчешће методе хибридизације користе ДНК сперме лососа или харинге за блокирање површине мембране и циљне ДНК, дејонизовани формамид и детерџенте као што је СДС да би се смањило неспецифично везивање проба.
После хибридизације, вишак пробе се испере са мембране (обично се користи SSC пуфер ). Образац хибридизације се на радиографском филму визуелно приказује ауторадиографијом у случају радиоактивне или флуоресцентне пробе или развијањем боје на мембрани ако се користи хромогена метода детекције.

Резултат

Хибридизација пробе на одређени фрагмент ДНК на мембрани филтера указује да овај фрагмент садржи ДНК секвенцу која је комплементарна проби. Корак преноса ДНК са гела за електрофорезу на мембрану омогућава лако везивање обележене хибридизационе пробе на фракционисану ДНК. Такође омогућава фиксацију хибрида циљна ДНК-проба, која је потребна за анализу ауторадиографијом или другим методама детекције.

Southern blot извршен рестрикционом дигестијом геномске ДНК може се користити за одређивање броја секвенци (нпр.броја копија гена) у геному . Проба која се хибридизира само на један ДНК сегмент који није пресечен рестрикцијским ензимом ће произвести једну траку на Southern blot-u, док ће се вероватно опажати више опсега када проба хибридизира на неколико врло сличних секвенци (нпр.Оних који може бити резултат дуплирања секвенци).

Модификација услова хибридизације (на пример, повећање температуре хибридизације или смањење концентрације соли) може се користити за повећање специфичности и смањење хибридизације пробе на секвенције мање од 100%.

Примене

Southern blot се може користити за клонирање засновано на хомологији на основу аминокиселинске секвенце протеинског производа циљног гена. Олигонуклеотиди су дизајнирани тако да су слични циљној секвенци. Олигонуклеотиди су хемијски синтетисани, радиоактивно обележени и користе се за претраживање ДНК библиотеке или друге колекције клонираних фрагмената ДНК. Секвенце које се хибридизирају пробом за хибридизацију даље се анализирају, на пример, да би се добила секвенца циљног гена.

Southern blot се такође може користити за идентификацију метилованих места у одређеним генима. Посебно су корисне рестрикционе нуклеазе MspI и HpaII, које обе препознају и одвајају се у истом низу. Међутим, HpaII захтева да се метилира цитозин унутар тог места, док MspI сече само неметиловану ДНК. Стога ће свако метиловано место унутар секвенце анализиране одређеном пробом сећи HpaII, а не MspI . ^[4]

Види још

Референце

^ Southern, Edwin Mellor (5. 11. 1975). „Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis”. Journal of Molecular Biology. 98 (3): 503—517. ISSN 0022-2836. PMID 1195397. doi:10.1016/S0022-2836(75)80083-0.
^ Towbin; Staehelin, T; Gordon, J; et al. (1979). „Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications”. PNAS. 76 (9): 4350—4. PMC 411572 . PMID 388439. doi:10.1073/pnas.76.9.4350.
^ Burnette, W. Neal (април 1981). „Western Blotting: Electrophoretic Transfer of Proteins from Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels to Unmodified Nitrocellulose and Radiographic Detection with Antibody and Radioiodinated Protein A”. Analytical Biochemistry. 112 (2): 195—203. ISSN 0003-2697. PMID 6266278. doi:10.1016/0003-2697(81)90281-5.
^ Biochemistry 3rd Edition, Matthews, Van Holde et al, Addison Wesley Publishing, pg 977

Спољашње везе

OpenWetWare

[[Категорија:Методи у молекуларној биологији]]

[1] Southern, Edwin Mellor (5. 11. 1975). „Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis”. Journal of Molecular Biology. 98 (3): 503—517. ISSN 0022-2836. PMID 1195397. doi:10.1016/S0022-2836(75)80083-0.

[2] Towbin; Staehelin, T; Gordon, J; et al. (1979). „Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications”. PNAS. 76 (9): 4350—4. PMC 411572 . PMID 388439. doi:10.1073/pnas.76.9.4350.

[3] Burnette, W. Neal (април 1981). „Western Blotting: Electrophoretic Transfer of Proteins from Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels to Unmodified Nitrocellulose and Radiographic Detection with Antibody and Radioiodinated Protein A”. Analytical Biochemistry. 112 (2): 195—203. ISSN 0003-2697. PMID 6266278. doi:10.1016/0003-2697(81)90281-5.

[4] Biochemistry 3rd Edition, Matthews, Van Holde et al, Addison Wesley Publishing, pg 977

[1]

[2]

[3]

[4]